蜂胶提取物对癌细胞的抑制作用研究论文

　　1 材料

　　1.1 蜂胶提取物取本地产蜂胶，冰冻粉碎后以95%乙醇浸泡72 h，过滤，滤液于40℃减压挥干溶剂，二甲基亚砜（DMSO）溶解定容为2 mg/ml。

　　1.2 试剂及仪器RPMI1640培养液为美国GIBCO公司产品；FACSCalibur流式细胞仪为美国BECTON DICKINSON公司产品；POD试剂盒购自华美生物工程公司；MRC-1024激光共聚焦显微镜（BIO-RAD公司产品）。

　　1.3 细胞株人喉鳞状细胞癌Hep-2细胞株由白求恩国际和平医院耳鼻喉头颈外科实验室惠赠。

　　2 方法

　　2.1 蜂胶浓度分组实验前用RPMI1640（Gibco公司）将蜂胶提取物稀释成20，40，80，160 μg/ml，DMSO的浓度低于0.02%。

　　2.2 流式细胞仪检测收集对照组和80 μg/ml蜂胶作用不同时间（24，48，72 h）的细胞，用PBS洗涤2遍，经柠檬酸缓冲液固定1 h以上，上机前加1 800 μl胰酶消化液充分作用，加入1 500 μl碘化丙啶（PI）作用15 min以上，过滤，上机进行细胞凋亡分析和细胞周期分析。

　　2.3 原位末端标记法（TUNEL）定量检测分别于各剂量药物作用后24，48，72 h收集细胞，PBS洗2次，细胞涂片，室温干燥。按原位细胞凋亡检测试剂盒说明进行操作，用普通光镜计算凋亡率（AI）。计算方法：随机选取5个高倍视野，分别计阳性细胞数及总细胞数，代入下式：AI=阳性细胞数/总细胞数×100%。

　　2.4 Hep-2细胞内Ca2+变化的激光共聚焦显微镜检测对数生长期Hep-2细胞，用D-Hanks液洗涤2次，于37℃避光条件下Fluo-3/AM（10 μmol/L）荷载。40 min后用D-Hanks液洗涤细胞3次，洗去细胞外残余染料，最后保留少许细胞外D-Hanks缓冲液，平衡10 min。经不同浓度蜂胶作用不同时间，在激光共聚焦显微镜下扫描细胞内荧光强度，激发波长488 nm，发射波长526 nm，以本底荧光强度为参照（0），检测细胞内Ca2+荧光强度。

　　2.5 数据统计学处理采用SPSS10.0统计软件进行统计处理，计量资料用±s表示，比较时采用t检验。α=0.050。

　　3 结果

　　3.1 流式细胞仪检查结果80 μg/ml蜂胶对Hep-2细胞凋亡率的影响：24，48，72 h时Hep-2细胞抑制率分别为36.2%，44.5%，58.6%，时间越长细胞凋亡率越高（P<0.05）。24，48，72 h时G0/G1期细胞分别占67.2%，55.8%，59.4%；S期分别占19.1%，28.3%，33.5%；G2/M期分别占13.7%，15.9%，7.1%。

　　3.2 TUNEL标记各组细胞凋亡率明显升高，与同时间对照组比较差异有显着性，且呈现一定的时间、剂量依赖性。与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，各时间组、各剂量组相关系数r经检验，P<0.013.3 Hep-2细胞内Ca2+的变化结果见表2。随药物浓度的增加，不同浓度组之间的细胞内Ca2+荧光强度亦增高。P<0.05。

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