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细胞生物学实验报告5

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细胞生物学实验报告5

湖南科技学院实验报告

学生姓名李诗学号201*07004215专业生物技术年级、班级1102

课程名称细胞生物学实验实验指导老师蒋琼凤、沈玉平

细胞中过氧化物酶的显示细胞凋亡的形态学检测与观察

一、实验目的:

1.掌握显示细胞中过氧化物酶反应的原理和方法。2.了解细胞凋亡的生物学意义

3.掌握凋亡细胞的形态学检测方法二、实验原理:

1.细胞内的过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物,用联苯胺处理标本,细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝,进而变为棕色产物,因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。中间产物蓝色联苯胺是不稳定的,无需酶的参加即可氧化为棕色化合物。

2.细胞凋亡是指细胞在生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的,基因控制的,一系列酶参与的过程。

3.凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体;根据细胞凋亡形态学特征进行显微观察是检测细胞凋亡的一种直观、可靠的方法。三、实验步骤:

细胞中过氧化物酶的显示

1、在载片上滴一滴PBS缓冲液;

2、取骨髓细胞:用断颈法处死小鼠,立即剪取后肢,去除肌肉,剥出后肢股骨,剪开股骨一端,用牙签尖的一端插入剪开的小孔中,抠取少许骨髓细胞置滴有PBS的载片上;

3、涂片:用另一玻片将骨髓细胞沿一个方向涂布推开,室温晾干;

4、媒染:在涂片上滴0.5%硫酸铜液,以盖满涂片为宜,处理30秒-1分钟。5、倾去硫酸铜液,直接滴入联苯胺混合液反应6分钟(以盖满涂片为宜)6、清水冲洗,番红复染2min。

7、镜检:清水冲洗,室温晾干,先低倍镜下观察,后换高倍镜下观察(油镜100×)

细胞凋亡的形态学检测与观察吉姆萨染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞3、95%乙醇固定5min

4、PBS缓冲液洗2次

5、吉姆萨染色液染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

7、普通光学显微镜下观察。吖啶橙染色:

1、取细胞爬片置于小培养皿中(有细胞面朝上)2、生理盐水轻轻漂洗细胞

3、甲醇:冰醋酸(3:1)固定5min4、PBS缓冲液洗2次每次1min

5、0.01%吖啶橙染色液在避光环境下染色5min6、蒸馏水轻轻洗去染液

6、选用蓝光激发滤片在荧光显微镜下观察。四、结果与分析:

1、根据随机选择的几个视野的统计,该样品的细胞凋亡率=227/506×100=44.9

Hela细胞凋亡过程中核染色质的形态变化(吖啶橙染色)

五、思考题:

1、细胞凋亡的调控机制

细胞凋亡是一个受基因调控、众多细胞膜受体和胞浆蛋白参与的细胞主动自杀过程,其触发因素多种多样,包括细胞内诱导因子和抑制因子对细胞凋亡的调控。

2、细胞凋亡的特征

凋亡细胞形态学特征是:体积变小,细胞质浓缩;细胞核发生染色质凝聚和聚集于核膜周围(边缘化);细胞膜有小泡状形成;晚期细胞膜内陷形成大小不同的凋亡小体。

3、研究细胞凋亡的方法

定性的研究方法:常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察(普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜)

定量或半定量的研究方法:各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。

扩展阅读:

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