细胞生物学实验报告

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动物细胞融合

【实验目的】

⒈了解动物细胞融合的常用方法。⒉学习化学融合的基本操作过程。

⒊观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】

细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。

⒈病毒诱导融合

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒和宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

⒉化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是被广泛使用的化学融合剂。

⒊电激诱导融合

包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验用品】

⒈材料

鸡血红细胞。⒉试剂

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。⒊器材

正置显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、注射器等。

【实验步骤】

⒈鸡血红细胞的制备和保存

用无菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再从鸡翼下静脉取血0.5~1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使总量为4~5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内。

⒉PEG诱导融合

⑴取保存的鸡血，离心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化钠溶液配制成5%~10%的悬液。

⑵称取1gPEG放入试管内，在沸水浴中融化后，加入1ml预热的Hank’s溶液，混匀，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5mlHank’s溶液混匀，然后以1000r/min离心5min，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置2~5min左右。

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⑸缓慢滴加6mlHank’s溶液以终止PEG的作用，混匀，静置5min。

⑹1000r/min离心3min，弃上清液后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖玻片镜检。

【实验结果】

【分析与讨论】

⒈结果分析

视野中有部分细胞出现融合现象，但是没有观察到细胞核。此外，视野中有些细胞发生重叠，是由于稀释不足造成的。

⒉注意事项

⑴制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。

⑵在离心之前，为了防止损坏仪器，应配平离心机。具体方法为：把相对的两个皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一个空的离心管，通过调节离心管中水的量来使天平达到平衡。

⑶在制片之前，应对细胞悬液进行充分稀释，以免细胞发生重叠，影响观察。⑷在制片之后，如鸡血红细胞悬液过多，则应用吸水纸吸去，以免弄脏物镜。⑸为了观察清楚，应把光线调暗，并改用小光圈。

【相关链接】

细胞融合技术的应用

⒈植物体细胞杂交

植物体细胞杂交（plantsomatic

hybridization）,又称原生质体融合（Protoplastfusion）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离

体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。

⒉单克隆抗体

单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。淋巴细胞杂交瘤是用人工方法使骨髓瘤细胞（纯系小鼠的腹水瘤型浆细胞）与已用抗原致敏并能分泌某种

第2页细胞生物学实验报告

抗体的淋巴细胞（常用致敏动物的脾细胞，起作用的是其中的B细胞）融合而成的。用来使上述淋巴细胞致敏的抗原有人和动物的T细胞、B细胞、红细胞、肿瘤细胞、各种微生物或其他抗原物质等。这种融合细胞既具有肿瘤细胞能大量、无限繁殖的特性，又具有B细胞能合成分泌特异性抗体的能力。由于一个B细胞克隆只针对一个

抗原决定簇产生相对应的抗体，所以一个B细胞与骨髓瘤细胞融合而成的单个杂交瘤细胞，也只产生某种单一的抗体。采用适当方法把杂交瘤细胞分离出来，进行单个细胞培养，使之大量繁殖，则在该培养液中增殖而形成的细胞克隆，只产生完全均一的、单一特异性的抗体，即单克隆抗体。若把能产生特异性抗体的单克隆杂交瘤进行大量培养，或注入原系动物腹腔中，则杂交瘤仍以腹水型方式生长，在培养液或腹水中会含有大量单克隆抗体。用杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体纯度高、专一性强、效价高，使用时可免除不同细胞及微生物种或株间血清学上的交叉反应，大大提高了诊断的特异性及敏感性。另外，在研究细胞表面标志、提纯可溶性抗原、进一步研究抗体的结构和功能等方面都起着十分重要的作用。

⒊细胞治疗

将自体细胞取出，经培养3-5周后再移植（注射）到自体的病患部位，达到替代受损细胞修复之目的，细胞治疗有长期的效果，细胞能释放自身的愈合和再生能力，治疗疾病（肿瘤；脏器；器官；疤痕；皱纹;皮肤化等）。

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⒋核移植

核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制。培养一段时间后，在把发育中的卵母细胞移植到人或动

物体内的方法。核移植的细胞来源主要分为：供体细胞来源和受体细胞的来源两种。核移植主要用于细胞移植和异种器官移植，细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引的各种疾病。

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扩展阅读：细胞生物学实验报告

实验六细胞膜的渗透性

一、实验目的

了解细胞膜[1]的渗透性及各类物质进入细胞的速度[2]

二、实验原理

1、在等渗溶液中，细胞对各种溶质的透过性不同。有的溶质可以进

入，有的溶质不能渗入。

2、渗入的溶质能提高细胞的渗透压，促进水分子进入细胞，引起溶

血现象[3]。

3、不同的溶质渗入到细胞内的速度不同，因此溶血时间也不同。

三、实验材料

新鲜血液（鸡血、猪血、牛血等）

四、实验器材

试管（1.5cmX18cm）、试管架、10ml移液管、1ml移液管、200ml烧杯（2个）、250ml容量瓶、移液枪、胶头滴管、菜刀、吸球、电子天平、显微镜、盖玻片、载玻片、秒表

五、实验药品及试剂0.17MNaCl、0.17MNH4Cl、0.17MNH4Ac、0.17MNaNO3、0.12MNa2SO4、0.12M草酸铵、0.32M葡萄糖、0.32M甘油、0.32M乙醇、0.32M丙酮、肝素抗凝剂[4]

六、实验步骤1、制备血液稀释液

（1）抗凝剂的制备：首先称取1克肝素钠粉末，然后加入0.17M

NaCl溶液10ml（1∶10的比例），混合均匀，制成肝素抗凝剂。

（2）血液稀释液的制备：取新鲜血液，按比例（肝素抗凝剂:血液

=1∶10）混合均匀，配制成经肝素抗凝的血液[5][6]。

（3）按比例（经肝素抗凝的血液∶0.17MNaCl溶液=1∶10）混

合均匀，形成一种不透明的红色液体[7]。

2、低渗溶液（空白对照）的观察

取试管一只，加入10ml蒸馏水，然后再加入1ml稀释的血液。注意观察溶液颜色的变化。结果是溶液由不透明的红色变为澄清。记录下这个过程所要的时间。3、红血球的渗透性

按表一的配制，分别在下列十种等渗溶液中进行实验。轻轻摇动，注意有无颜色变化，是否有溶血现象发生，记下时间（自加入稀释血液到溶液逐渐由红色变为透明澄清，红血球全部溶血所需时间），填入表一的空格中。4、显微观察

[1]何为细胞膜？[5]注意：这一步，动作要非常迅速，否则鸡血会凝固。或者先把抗凝剂加入到烧杯中，再加入新鲜的[2]鸡血，边加边震荡即可。为何不同物质进入细胞的速度不同？[6]为什么新鲜的鸡血会凝固？[3]何为溶血现象？[7]为什么这一步要使用0.17M的NaCl溶液？[4]你知道有哪些血液抗凝剂？（1）血液红细胞的观察

滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片。用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色。

（2）细胞破碎的观察

在上一步的载玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。

七、实验结果与分析

1、比较和分析你所观察到的实验结果，并解释原因。

结果：

（1）在所提供的试剂中不溶血的有：

（2）在所提供的试剂中不完全溶血的有：（3）在所提供的试剂中完全溶血的有：结果分析与比较：结论：

2、绘制你所观察到的血液细胞图。

3、讨论溶血实验在研究中应用的可能性。附1：试剂配制表

1、0.17MNaCl需要＿＿＿＿＿＿克NaCl，定容至100ml。2、0.17MNH4Cl需要＿＿＿＿＿＿克NH4Cl，定容至100ml。3、0.17MNH4Ac需要＿＿＿＿＿＿克NH4Ac，定容至100ml。4、0.17MNaNO3需要＿＿＿＿＿＿克NaNO3，定容至100ml。5、0.12MNa2SO4需要＿＿＿＿＿＿克Na2SO4，定容至100ml。6、0.12M草酸铵需要＿＿＿＿＿＿克草酸铵，定容至100ml。7、0.32M葡萄糖需要＿＿＿＿＿＿克葡萄糖，定容至100ml。8、0.32M甘油需要＿＿＿＿＿＿克甘油（100%），定容至250ml。9、0.32M乙醇需要＿＿＿＿＿＿克无水乙醇，定容至250ml。10、0.32M丙酮需要＿＿＿＿＿＿克丙酮，定容至250ml。

附2：表一在不同低渗溶液下溶血现象的调查

编号12345678910试剂10ml0.17MNaCl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Cl+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNH4Ac+1ml稀释的鸡血10ml0.17MNaNO3+1ml稀释的鸡血10ml0.12MNa2SO4+1ml稀释的鸡血10ml0.12M草酸铵+1ml稀释的鸡血10ml0.32M葡萄糖+1ml稀释的鸡血10ml0.32M甘油+1ml稀释的鸡血10ml0.32M乙醇+1ml稀释的鸡血10ml0.32M丙酮+1ml稀释的鸡血是否溶血时间

附3：溶血结果的判断

（1）不溶血：液体分2层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好。（2）不完全溶血：溶液混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞破裂。（3）完全溶血：液体变红而且透明，镜检发现细胞全成碎片。

附4：细胞膜内外物质交换示意图

原始生命向细胞进化所获得的重要形态特征之一，是生命物质外面出现了一层膜性结构，即细胞膜。细胞膜和细胞内膜系统总称为生物膜(biomembrane)。

细胞膜(cellmembrane)，又称原生质膜，是细胞结构中分隔细胞内、外不同介质和组成成分的界面。其厚度通常为7～8nm，由脂类和蛋白质组成。一般蛋白质占60%-80%，类脂占20%-40%，碳水化合物约占5%。关于细胞膜的结构模型，流体镶嵌模型是目前被最广泛接受和认可的观点。该模型由美国加州大学的辛格(S.J.Singer)和尼克森(G.L.Nicolson)于1972年提出。该模型突出了膜的流动性和不对称性，其结构特征是：生物膜的骨架是磷脂双分子层，其中磷脂分子的疏水性尾部相对，极性头部朝向水相。蛋白质或嵌在脂双层表面，或嵌在其内部，或横跨整个脂双层，表现出分布的不对称性。根据在膜上的位置不同，膜蛋白可分为两类：通过强疏水或亲水作用同膜脂牢固结合不易分开的，称为整合蛋白(integralprotein)或内在蛋白；附着在膜表层，与膜结合比较疏松容易分离的，称为外周蛋白(peripheralprotein)。细胞膜的表面还有糖类分子，形成糖脂、糖蛋白。因脂双层具有流动性，故蛋白质分子也可以在脂双层中横向移动；又因膜的内外表面上脂类和蛋白质的分布不均匀，反映了膜两侧的功能不同。

细胞膜是细胞与周围环境和细胞与细胞间进行物质交换和信息传递的重要通道。其最重要的特性是半透性，或称选择透过性，对进出入细胞的物质有很强的选择透过性。这是细胞膜最基本的一种功能，如果丧失了这种功能，细胞就会死亡。细胞膜的功能有：

1)分隔形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大

增加，提高了发生在膜上的生物功能；

2)屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过；3)选择性物质运输，伴随着能量的传递；

4)生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等；5)物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的转运功能实现的，其主要转运方式有四种，即单纯扩散、易化扩散、主动转运、入胞和出胞作用。6)细胞膜的受体功能：受体是细胞识别和结合化学信息的特殊结构，其本质是蛋白质。实验八细胞融合实验目的

掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。实验用品

1.材料鸡红细胞

2.器材和仪器普通光学显微镜、普通低速离心机、恒温水浴箱、刻度离心管、试管、载玻片、盖玻片

3.试剂50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)、生理盐水实验内容

一、原理

细胞融合(Cellfusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。

细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendaivirus)，聚乙二醇

(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。二、方法

1.取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。2.称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的37℃Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中备用。

3.取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，沿离心管壁滴加50％PEG溶液，边加边晃动试管使之混匀，37℃水浴20min。

4.取出离心管，缓慢滴加9mlHanks液以终止PEG的作用，800g离心3min，弃上清。5.用贴壁的液体重悬细胞，取一滴制成滴片，加盖片镜检。结果：在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。三、融合率的计算

在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：

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