细胞生物学实验报告

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动物细胞融合

【实验目的】

⒈了解动物细胞融合的常用方法。⒉学习化学融合的基本操作过程。

⒊观察动物细胞融合过程中细胞的行为和变化。

【实验原理】

细胞融合是指在自发或者诱导条件下，两个或两个以上细胞合并为双核或者多核细胞的过程。目前人们已经发现有很多方法可以诱导细胞融合，包括病毒诱导融合、化学诱导融合和电激诱导融合。

⒈病毒诱导融合

仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可介导病毒和宿主细胞融合，同时也可介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。

⒉化学诱导融合

很多化学试剂能够诱导细胞融合，如聚乙二醇(PEG)、二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂、磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复过程中相接触的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是被广泛使用的化学融合剂。

⒊电激诱导融合

包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力的作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制、融合概率高、无毒性、作用机制明确、可重复性高等优点。

【实验用品】

⒈材料

鸡血红细胞。⒉试剂

50%PEG、Hank’s溶液(pH7.4)、Alsever’s细胞保存液、0.85%氯化钠溶液。⒊器材

正置显微镜、离心机、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、注射器等。

【实验步骤】

⒈鸡血红细胞的制备和保存

用无菌注射器先吸入Alsevers溶液1ml，再从鸡翼下静脉取血0.5~1ml，取出后放入刻度离心管中，再加入2~3mlAlsevers溶液，使总量为4~5ml，混匀并封口，置于4℃冰箱内。

⒉PEG诱导融合

⑴取保存的鸡血，离心去除Alsevers溶液，以0.85%氯化钠溶液配制成5%~10%的悬液。

⑵称取1gPEG放入试管内，在沸水浴中融化后，加入1ml预热的Hank’s溶液，混匀，制成50%的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。

⑶取上述鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5mlHank’s溶液混匀，然后以1000r/min离心5min，小心弃去上清液，用指弹法将细胞团块弹散。

⑷取上述50%PEG溶液1ml，在1min内滴加到鸡红细胞悬液中，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置2~5min左右。

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⑸缓慢滴加6mlHank’s溶液以终止PEG的作用，混匀，静置5min。

⑹1000r/min离心3min，弃上清液后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖玻片镜检。

【实验结果】

【分析与讨论】

⒈结果分析

视野中有部分细胞出现融合现象，但是没有观察到细胞核。此外，视野中有些细胞发生重叠，是由于稀释不足造成的。

⒉注意事项

⑴制备的鸡血红细胞悬液的浓度不宜过高，否则细胞容易聚集，融合效果受影响。

⑵在离心之前，为了防止损坏仪器，应配平离心机。具体方法为：把相对的两个皮套放在天平上秤，在皮套中央各放置一个空的离心管，通过调节离心管中水的量来使天平达到平衡。

⑶在制片之前，应对细胞悬液进行充分稀释，以免细胞发生重叠，影响观察。⑷在制片之后，如鸡血红细胞悬液过多，则应用吸水纸吸去，以免弄脏物镜。⑸为了观察清楚，应把光线调暗，并改用小光圈。

【相关链接】

细胞融合技术的应用

⒈植物体细胞杂交

植物体细胞杂交（plantsomatic

hybridization）,又称原生质体融合（Protoplastfusion）是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离

体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。

⒉单克隆抗体

单克隆抗体是由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体。淋巴细胞杂交瘤是用人工方法使骨髓瘤细胞（纯系小鼠的腹水瘤型浆细胞）与已用抗原致敏并能分泌某种

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抗体的淋巴细胞（常用致敏动物的脾细胞，起作用的是其中的B细胞）融合而成的。用来使上述淋巴细胞致敏的抗原有人和动物的T细胞、B细胞、红细胞、肿瘤细胞、各种微生物或其他抗原物质等。这种融合细胞既具有肿瘤细胞能大量、无限繁殖的特性，又具有B细胞能合成分泌特异性抗体的能力。由于一个B细胞克隆只针对一个

抗原决定簇产生相对应的抗体，所以一个B细胞与骨髓瘤细胞融合而成的单个杂交瘤细胞，也只产生某种单一的抗体。采用适当方法把杂交瘤细胞分离出来，进行单个细胞培养，使之大量繁殖，则在该培养液中增殖而形成的细胞克隆，只产生完全均一的、单一特异性的抗体，即单克隆抗体。若把能产生特异性抗体的单克隆杂交瘤进行大量培养，或注入原系动物腹腔中，则杂交瘤仍以腹水型方式生长，在培养液或腹水中会含有大量单克隆抗体。用杂交瘤技术制备出来的单克隆抗体纯度高、专一性强、效价高，使用时可免除不同细胞及微生物种或株间血清学上的交叉反应，大大提高了诊断的特异性及敏感性。另外，在研究细胞表面标志、提纯可溶性抗原、进一步研究抗体的结构和功能等方面都起着十分重要的作用。

⒊细胞治疗

将自体细胞取出，经培养3-5周后再移植（注射）到自体的病患部位，达到替代受损细胞修复之目的，细胞治疗有长期的效果，细胞能释放自身的愈合和再生能力，治疗疾病（肿瘤；脏器；器官；疤痕；皱纹;皮肤化等）。

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⒋核移植

核移植是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中，使后者不经精子穿透等有性过程即可被激活、分裂并发育，让核供体的基因得到完全复制。培养一段时间后，在把发育中的卵母细胞移植到人或动

物体内的方法。核移植的细胞来源主要分为：供体细胞来源和受体细胞的来源两种。核移植主要用于细胞移植和异种器官移植，细胞移植可以治疗由于细胞功能缺陷所引的各种疾病。

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