兽医(动医)药理学教学实践开题报告
四川农业大学
兽医药理学教学实践开题报告
琼脂扩散纸法测定20种药物对大肠杆菌的敏感性及MIC、MBC测定
专业：动物医学班级:零八级六班指导教师：林居纯（副教授）
二○一○年十二月
琼脂扩散纸法测定20种药物对大肠杆菌的敏感性及MIC、MBC测定组员信息表（四川农业大学动医08级6班，625014）【实验背景及意义】大肠杆菌是畜禽肠道内的常见细菌，体弱和幼龄动物受气温变化或食物变换等因素的影响时，肠道内的这些条件性病原菌便大量繁殖，引起肠道疾病。将采集的大肠杆菌在培养基上培养生长，再制备各种抗菌药片进行药敏试验。本试验通过药敏试验来检测这种病原菌对不同抗菌药物的敏感性及最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），以选择出有效药物用于预防和治疗这类疾病，同时避免了滥用药物而形成耐药菌株。【实验原理】用浸有药物的药敏纸片贴在接种有大肠杆菌的培养基内，药物会沿着琼脂向周围扩散，药物会影响大肠杆菌的生长繁殖，因此可抑制其生长的药物可致纸片周围出现一圈不生长细菌的区域，称为抑菌圈，表示此药物对大肠杆菌的生长繁殖具有抑制作用。通过测定抑菌圈的直径大小可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用就越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用就越弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。将抗菌药物梯度稀释、制备成培养基，用琼脂法和液体法测定MIC。将液体发中无细菌生长的各菌液接种于无抗生素的CDC琼脂培养基上，可测定该药物的MBC。【材料】1、药品及细菌氨苄青霉素、红霉素、氟苯尼考、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、土霉素、氟哌酸、环丙沙星、恩诺沙星、左氟沙星、利福平、链霉素、磺胺异恶唑、磺胺脒、甲溴东莨菪碱、头孢噻呋、甲硝唑共19种抗菌药物；生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基；大肠杆菌。2、器材药敏纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿（30个，5种／个，6组／种）、镊子、打孔器、无菌操作台、酒精灯、96孔药敏实验板（24个，第一次12个，第二次12个）、高压锅、接种环、恒温培养箱、CDC厌氧琼脂培养基【实验方法及内容】Ⅰ、药物敏感性测定1、药敏纸片的制备（1）药敏纸片制备和烘干的圆片，每20片放入一个小广口瓶中，取质量好的滤纸，用打孔器打成直径6mm15min）干热灭菌（160℃，2h），或湿热灭菌（121℃，，在60℃下烘干。（2）药物稀释根据药物说明进行药物配比，如规格为100g装的抗菌药物，包装说明兑水400斤，即用天平称取药物1g加入50ml蒸馏水置于灭菌平皿内，充分溶解后吸取1ml，置于另一）个灭菌的容器中再加入39ml蒸馏水（50×40。（3）纸片浸泡、干燥取配好的药物溶液放入盛有纸片的小瓶内（药物的多少一浸透纸片为宜），浸泡24h37℃的烘箱内烘干，而后加盖至4~8℃的后将多余的药液倒掉，在无菌条件下晾干或在冰箱中保存备用。
2、细菌的转种、活化培养（1）用无菌拭子将细菌接种到MH培养基中（6个），保证细菌均匀的涂布在培养基中。注意无菌操作。（2）将培养基置于37℃的恒温箱中培养24h。3、接种、贴药敏纸片（1）将上一步活化培养成功的细菌接种于培养基中，用无菌的镊子轻轻夹取药敏纸片贴在平板表面，注意将纸片铺平，与琼脂充分接触，已经贴下机遇不可再揭起，纸片与纸片的距离应不少于24mm,纸片中心距离边缘不少于15mm，15min内应贴完所有纸片。（2）将培养基置于37℃的恒温箱中，培养24h。4、结果判断纸片法药物敏感性判断标准抑菌圈直径（mm）敏感度20mm及以上极敏15~20mm高敏10~14mm中敏10mm以下低敏0mm不敏
Ⅱ、药物MIC、MBC的测定1、细菌的转种、活化培养将菌株接种于5mlCDC厌氧培养基中，常规厌氧培养48h。2、细菌接种将抗菌药物梯度稀释、制备成药物浓度分别为1,0.5,0.25,0.0625μg／ml的CDC厌氧琼脂培养基和CDC厌氧液体培养基，将细菌划线接种于琼脂培养基（注意无菌操作）并另取0.5ml菌液接种于液体培养基。37℃厌氧培养72h。3、将CDC厌氧液体培养基中无细菌生长的各菌液分别接种于无抗生素的CDC琼脂培养基上，常规培养72h。4、结果判定琼脂培养基上无细菌生长的最低药物浓度为MIC，液体培养基中混浊者为有菌生长，澄清者为无菌生长，无菌生长的最低药物浓度为其MIC。步骤3中无细菌生长的最低药物浓度为其MBC。【讨论】1、评价抗菌药物抗菌作用的方法有哪些？2、不同抗菌药物的抗菌原理。3、确保本实验成功的关键？有哪些地方需要改进？
扩展阅读：兽医药理学教学实践结题报告——纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性
兽医药理学实践教学结题报告
纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性
专业班级：指导老师：完成时间：实践地点：
大肠杆菌对6种抗生素的敏感性检测
（四川农业大学动物医学
201*级1班）
摘要：大肠杆菌病(Colibacillosis)是由致病性大肠杆菌引起的消化道传染病，流行广，发病率和死亡率较高。这种病原菌主要经动物的消化道而感染。能够引起多种畜禽发生急性、慢性或隐性感染。药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。以防盲目地滥用抗菌药物,造成药物的浪费,同时也贻误了治疗时机，会给养殖户造成了很大的经济损失。
关键词：大肠杆菌抗生素敏感性
前言：致病性大肠杆菌是引起动物感染最常见的病原微生物，它可引起畜禽发生严重腹泻和败血症等，给养殖业造成了巨大的经济损失。抗菌药物的应用在很大程度上控制了这类病原菌的发生。但是随着药物的广泛使用，尤其不合理用药，耐药细菌迅速产生，多重耐药现象日趋严重，严重影响抗菌药物的有效使用，给新药的开发带来巨大压力，同时也带来了动物源食品的安全性问题，对人类的健康构成了潜在威胁[1,2]。本次实验初步了解了各场大肠杆菌耐药性的发生和流行现状，为养殖场合理用药提供依据。
一、实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。二、实验材料
1.药品及细菌诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。
2.器材纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、1000ml烧杯、PH试纸、量筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器。三、实验步骤1.培养基的制备：
MH（Mueller-Hinton）琼脂平板的制备方法：组成：牛肉粉
300g17.5g1.5g
水解酪蛋白可溶性淀粉
蒸馏水加至1000ml，pH调制7.4±0.2，（约每升含Ca2+500mg、Mg2+25mg）
按上述配比称取各试剂于烧杯内加入蒸馏水加热溶解，调整pH值，使其高压灭菌后的pH
为7.4，加蒸馏水至所需的体积，放于三角瓶内，用棉塞塞好，以15～20磅压力灭菌20min，后趁热倒入预先灭菌过的培养皿中，平放冷却，即为MH肉汤培养基。
注：有的菌不在其中生长者，可在其中加入5～10g葡萄糖或5%（体积分数）羊血或10%（体积分数）兔血清。
MH琼脂平板就是在上述培养基中加入17g的琼脂粉即可。2.药敏纸片的制备2.1纸片制备
选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成直径6mm的圆形滤纸片。每200张一管，经120℃2h灭菌后备用。2.2药物稀释
每张以吸入20μL药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。根据纸片内各种抗菌药物的不同浓度配制药物原液，其浓度需比纸片浓度大200倍，如青霉素G的纸片为10U/片，青霉素G的原液浓度为201*U/mL，200张纸片内即加入1mL青霉素G原液。药液浓度见下表。
纸片内抗菌药物含量抗生素甲氧苯青霉素氨苄青霉素羧苄青霉素大环内酯类杆菌肽头孢菌素类纸片浓度U/μg/片5μg10μg抗生素卡那霉素链霉素纸片浓度U/μg/片30μg10μg10μg10μg30μg30μg抗生素纸片浓度U/μg/片2μg30μg300U30μg15μg5μg氯林肯霉素（对阳性菌）万古霉素多粘菌素B四环素类红霉素利福平100μg妥布霉素15μg10U30μg庆大霉素新生霉素新霉素2.3纸片浸润、干燥、保存
用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml（含药量按表所列计算，例如，庆大霉素10μg/片×100片=1000μg/ml），加入摊布于灭菌平皿中的100片纸片中，置冰箱内浸泡1~2小时，必要时可不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，如立即实验可不烘干，若保存备用可用下列一种方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。
A．培养皿烘干法将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃温箱内保持2~3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
B．真空抽干法将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥器了，用真空抽气机抽干。
纸片的保存将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中置冰箱内保存备用。（纸片不应长期保存于常开的普通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器中。）收到纸片后应立即保存在-20~4℃中，由于实验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完的放回冰箱中。3.细菌的制备
从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。也可直接从孵育18～24h的琼脂平板上挑去纯菌落制成肉汤。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。
下表为麦氏比浊管制法：试管（口径相等）10g/LBaCl2（mL）1%纯硫酸123456789100.10.20.30.40.50.60.70.80.91.09.99.89.79.69.59.49.39.29.19.06912151821242730相当细菌数（亿/mL）3
4.接种平板
制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤
压几次，去掉过多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。5.粘贴药敏试纸
待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，
用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂中。纸片间距离不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。直径为90mm的平板最好贴6张。贴好纸片后，需在15min内置35℃培养箱内培养。培养时，平板需在培养箱内单独摆放，否则中间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养18～24h后，读取结果。四、结果判定
培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为抑菌圈边缘。按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。
抑菌圈直径（mm）20mm及以上15～20mm10～14mm10mm以下0mm五、实验结果
大肠杆菌对7种药物的敏感性抑菌药物卡那霉素新霉素氟苯尼考抑菌圈直径（mm）敏感度22.56高敏23.16高敏25.62高敏敏感度极敏高敏中敏低敏不敏多黏菌素诺氟沙星泰乐菌素
六、结果分析与讨论
9.6123.5823.63低敏高敏高敏1.抗菌药物敏感性试验方法－纸片扩散法
药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。抗菌药物敏感性试验方法很多，常见有纸片扩散法，稀释法，E试验。本实验中采用纸片扩散法，操作简便，所需器材简单。通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理,测定抗菌药物的质量,防伪劣假冒产品和过期失效药物。
2.实验中大肠杆菌的耐药情况
大肠杆菌对24种抗菌药物的敏感性如上表所示。从表中可以看出，大肠杆菌对多粘菌素的敏感性较低外，对诺氟沙星、新霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素等5种抗菌药物抗菌药物都显示很高的敏感性。
由此可见，实验中所采用的大肠杆菌还未产生明显的耐药性。该株大肠杆菌对多粘菌素的敏感性明显降低，说明其耐药性有上升趋势，应注重平时抗生素的合理使用。3.实验中抗生素的主要作用
诺氟沙星具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，对肠杆菌科的大部
分细菌在体外具良好抗菌作用，体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。诺氟沙星为杀菌剂，通过作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA的合成和复制而导致细菌死亡。
新霉素对葡萄球菌、棒状杆菌属有良好作用，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属等肠杆菌科细菌亦有良好作用，对各组链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属等活性差，铜绿假单胞菌、厌氧菌等对本品耐药。
链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦对该品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。各组链球菌、铜绿假单胞菌和厌氧菌对该品耐药。
氟苯尼考对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等均有作用。
泰乐菌素在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌、肺炎双球菌、丹毒杆菌、副嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、巴氏杆菌、螺旋体、球虫等病原体引起的各种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感染。并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红霉素和泰妙菌素。
4.控制细菌耐药性的主要对策[3~6]
4.1普及相关医疗知识，合理使用抗菌药物
细菌耐药性的出现主要是在临床上滥用抗生素的结果。特别是在畜禽养殖业中，基层人员缺乏相关的知识，认为只要加大剂量、延长疗程使用就一定能控制疾病，而全然不考虑药物的残留和耐药性的产生。因此，应加强基层医务人员的相关医疗知识，用药时要严格掌握适应症、适当的剂量和疗程，既要避免剂量过大造成的药物浪费和毒性反应的出现，又要注意剂量不足而导致疾病的复发及耐药性的产生。严格掌握抗菌药物的局部用药、预防用药和联合用药，避免滥用。在控制动物疾病时尽量减少抗菌药物的使用，最好的方法是改善动物的饲养条件，防止疾病发生。4.2加强药政管理
严格控制抗菌药物的审批、生产标准，加强抗菌药物的质量监督，控制抗菌药物的使用管理。
4.3研制和开发新的药物
根据细菌耐药性的发生机制及其与抗菌药物结构的关系，寻找和研制具有抗菌活性，尤其对耐药菌有活性的新抗菌药；同时可以针对某些因细菌灭活酶而失效的抗菌药物，寻找适当的酶抑制剂，与抗菌药物联合应用时可保护药物不受灭活酶的破坏而保存其抗菌活性。4.4开发不使用抗菌药来治疗感染的治疗策略
参考文献：
[1]郝秀红,马聪等.1991~1999年临床常见病原菌及耐药现状[J].中国抗生素杂志,201*,26(6):477~449[2]朱力军.动物大肠杆菌耐药性的变化趋势[J].中国兽药杂志,201*,35(2):16~18[3]陈代杰主编.抗菌药物与细菌耐药性[M].上海,华东理工出版社,201*:169~185[4]蒋红霞,曾振灵.细菌耐药机制及耐药性控制对策[J].动物医学进展.201*,22(4):4~7[5]朱力军.加强兽用抗生素管理控制抗生素耐药性[J].中国兽药杂志,201*,34(5):55~56
[6]王红宁.猪、禽安全生产中主要病原菌耐药性检测及控制技术研究进展[J].四川畜牧兽医,201*，
154(30):60~63
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